眾所周知，CRISPR（全稱clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即“成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列”）是廣泛分布于細(xì)菌和古菌中的一種獲得性免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)首先從外源病毒（或質(zhì)粒）中獲取特定DNA片段并作為間隔序列（spacer）存儲(chǔ)在其CRISPR中，此過(guò)程稱為“適應(yīng)”；然后利用相應(yīng)spacer產(chǎn)生的crRNA識(shí)別和降解攜帶同源序列的外源質(zhì)�；虿《荆诉^(guò)程稱為“干擾”。顯而易見(jiàn)，適應(yīng)過(guò)程獲得的spacer決定了干擾機(jī)器的靶分子。然而多年來(lái)，CRISPR如何在適應(yīng)過(guò)程中區(qū)分異己的外源DNA和自身的染色體DNA一直困擾著科學(xué)家們。有意思的是，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的單一病毒侵染細(xì)菌的模型中，CRISPR適應(yīng)過(guò)程很難發(fā)生，這嚴(yán)重地阻礙了該領(lǐng)域的研究，因此CRISPR適應(yīng)過(guò)程也是CRISPR研究領(lǐng)域中目前相對(duì)最不清楚的過(guò)程。最近，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所向華研究員帶領(lǐng)的極端嗜鹽古菌研究團(tuán)隊(duì)在這一領(lǐng)域取得重要發(fā)現(xiàn)，近期連續(xù)兩篇相關(guān)論文發(fā)表在國(guó)際知名期刊Nucleic Acids Research上。
該研究團(tuán)隊(duì)首先從遼寧葫蘆島的鹽場(chǎng)中分離到了一株新的嗜鹽病毒HHPV-2，并在利用該病毒侵染西班牙鹽盒菌時(shí)觀察到了高效的CRISPR適應(yīng)現(xiàn)象。通過(guò)大量的遺傳與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)該嗜鹽古菌CRISPR適應(yīng)過(guò)程不僅需要干擾機(jī)器的參與，而且需要CRISPR結(jié)構(gòu)中已經(jīng)存在的一個(gè)spacer，該spacer與病毒基因組上的某段序列具有約70%的相似性�；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，他們推測(cè)CRISPR系統(tǒng)借助攜帶該spacer序列信息的干擾機(jī)器，可特異地將病毒DNA識(shí)別為異己分子，并在相似序列所在DNA分子上“引發(fā)”了適應(yīng)過(guò)程。接著，他們利用該“引發(fā)”模型，成功實(shí)現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)從特定的重組質(zhì)粒上高效獲取新spacer，驗(yàn)證了該機(jī)制，并進(jìn)一步解析了從病毒或質(zhì)粒上獲取新spacer的鏈偏好性。該工作充分說(shuō)明了“引發(fā)”機(jī)制在適應(yīng)過(guò)程中具有重要的異己識(shí)別作用，并有利于其在自然環(huán)境中對(duì)病毒群的整體適應(yīng)。相關(guān)論文發(fā)表在Nucleic Acids Res. 42(4):2483-2492上，博士生李明和王銳是該篇論文的并列第一作者。
接著，該組研究人員構(gòu)建了64種重組質(zhì)粒，使它們攜帶相同的protospacer序列和64種不同的三聯(lián)核苷酸充當(dāng)其PAM（protospacer adjacent motif）。有意思的是，CRISPR只能干擾其中4種PAM對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒，卻能“引發(fā)”23種PAM對(duì)應(yīng)質(zhì)粒（包括被干擾的4種）的適應(yīng)過(guò)程，而其它41種PAM質(zhì)粒則安全“躲避”了CRISPR系統(tǒng)的免疫。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證明位于宿主CRISPR結(jié)構(gòu)中spacer旁邊保守的三聯(lián)核苷酸AGC（屬于上述41種PAM），是幫助spacer同時(shí)“躲避”了干擾和引發(fā)適應(yīng)過(guò)程的決定性因素。該研究表明PAM驗(yàn)證機(jī)制在適應(yīng)過(guò)程和干擾過(guò)程中都發(fā)揮重要作用，但在適應(yīng)過(guò)程中表現(xiàn)出更寬松的PAM選擇性，因此該過(guò)程能耐受靶分子上更多的PAM突變，同時(shí)PAM驗(yàn)證機(jī)制又可以避免在宿主自身的spacer DNA處引發(fā)適應(yīng)過(guò)程。該工作進(jìn)一步解析了CRISPR適應(yīng)過(guò)程中的異己區(qū)分機(jī)制，即“PAM驗(yàn)證的引發(fā)機(jī)制”。相關(guān)論文已于近期在線發(fā)表在Nucleic Acids Research (doi: 10.1093/nar/gku389) 上，博士生李明為該篇論文的第一作者。
上述研究工作受到向華主持的國(guó)家杰出青年科學(xué)基金和國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目的資助。
CRISPR干擾與引發(fā)適應(yīng)過(guò)程的異己區(qū)分模型
