【生產(chǎn)廠家】深圳市匹基生物工程有限公司
【批準(zhǔn)文號(hào)】國(guó)藥準(zhǔn)字S20020041
【劑 型】檢測(cè)試劑盒
【規(guī) 格】24tests/盒
【醫(yī)保類型】
【國(guó)家基本藥物】否
【正文】
人類免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸擴(kuò)增（PCR）熒光定量檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書
Operation Introduction for Quantitative Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) PCR Fluorogence Diagnostic Kit
前言:
本試劑盒利用一對(duì)人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的特異性引物、一個(gè)特異性熒光探針，采用逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV-1 RNA gag基因區(qū)域的擴(kuò)增。選取的靶區(qū)域是gag基因區(qū)域中部的一段保守區(qū)，長(zhǎng)度102bp。gag基因位于HIV-1基因組的5’端約790—2292nt處，編碼核衣殼蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白。試劑盒同時(shí)利用熒光探針(Taqman探針和雜交雙探針)檢測(cè)技術(shù)，該探針能與引物擴(kuò)增區(qū)域中間的一段模板發(fā)生特異性結(jié)合，隨著PCR過(guò)程的進(jìn)行，熒光信號(hào)發(fā)生相應(yīng)的變化，使用在線監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀，即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核苷酸序列的擴(kuò)增及自動(dòng)檢測(cè)。本試劑盒還應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)技術(shù)，該內(nèi)標(biāo)與靶序列共用一對(duì)引物，而只在探針結(jié)合部位與靶序列有所不同。這種在提取、逆轉(zhuǎn)錄以及PCR擴(kuò)增效率方面均與待檢測(cè)樣本核酸片段相同的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的加入，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)樣本RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄等過(guò)程的全程監(jiān)控，還可以監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，對(duì)樣本中影響PCR反應(yīng)體系的各種因素進(jìn)行修正，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血漿樣本中HIV-1 RNA的定量檢測(cè)。本試劑盒還對(duì)引物和探針進(jìn)行了優(yōu)化，使得對(duì)HIV-1 B,B’,C,E等中國(guó)主要流行亞型有相似的擴(kuò)增效率。
本品用于人血漿樣本中的HIV-1 RNA的定量測(cè)定，適用于HIV感染的輔助診斷，抗HIV-1藥物治療的效果的檢測(cè)。
抗病毒藥物的療效評(píng)價(jià)主要直接依賴兩個(gè)指標(biāo):血漿中HIV RNA滴度和CD4+細(xì)胞數(shù)。在抗病毒藥物治療的跟蹤中，本試劑盒可定量測(cè)定血漿中HIV RNA滴度，動(dòng)態(tài)地反映治療中HIV RNA滴度的變化，為療效評(píng)價(jià)提供指標(biāo)。
當(dāng)前對(duì)HIV／AIDS的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，即HIV抗體檢測(cè)�？贵w檢測(cè)很大程度上降低了HIV經(jīng)血傳播的危險(xiǎn)性，但由于窗口期的存在，仍然不能完全避免。P24抗原檢測(cè)可將“窗口期”縮短5-6天，但其在外周血中的存在時(shí)間非常短。而核酸檢測(cè)方法可將“窗口期”縮短10-15天，更進(jìn)一步降低了HIV經(jīng)血傳播的危險(xiǎn)性。HIV核酸檢測(cè)的對(duì)象還包括HIV陽(yáng)性母體所生的嬰兒、陽(yáng)性患者的性伴侶、靜脈吸毒者和可疑的血清反應(yīng)者。
試劑盒原理
RT-PCR
本試劑盒利用一對(duì)人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的特異性引物，采用逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，應(yīng)用RT-PCR首先對(duì)HIV-1 RNA上的靶序列實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
FQ-PCR
采用FQ-PCR對(duì)前期RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。FQ-PCR采用熒光探針(Taqman探針或雜交雙探針)檢測(cè)技術(shù)，除常規(guī)的一對(duì)引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個(gè)能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的5"端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3"標(biāo)記另一個(gè)熒光基團(tuán)。此時(shí)5"端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3’端熒光淬滅基團(tuán)，因此正常情況下檢測(cè)不到該探針5"端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。但當(dāng)溶液中有模板時(shí)，模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；Taq酶的5"—3’外切酶活性將探針5"端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光，切割的熒光基團(tuán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。使用在線監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中的熒光信號(hào)，即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核苷酸序列的擴(kuò)增及自動(dòng)檢測(cè)。
擴(kuò)增靶序列
選取的靶區(qū)域是HIV gag基因區(qū)域中部的一段保守區(qū)，長(zhǎng)度102bp。gag基因位于HIV-1基因組的5’端約790—2292nt處，編碼核衣殼蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白。本試劑盒還對(duì)引物和探針進(jìn)行了優(yōu)化，使得對(duì)HIV-1 B，B’,C,E等中國(guó)主要流行亞型有相似的擴(kuò)增效率。
競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)
本試劑盒包含有一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，該體外合成的內(nèi)標(biāo)與靶序列共用一對(duì)引物，而只在探針結(jié)合部位與靶序列有所不同。這種在提取、逆轉(zhuǎn)錄以及PCR擴(kuò)增效率方面均與待檢測(cè)樣本核酸片段相同的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的加入，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)樣本RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄等過(guò)程的全程監(jiān)控，還可以監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，對(duì)樣本中影響PCR反應(yīng)體系的各種因素進(jìn)行修正，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血漿樣本中HIV-1 RNA的定量測(cè)定。
防污染擴(kuò)增
本試劑盒采用尿嘧啶糖基酶(UNG)—dUTP系統(tǒng)對(duì)臨床樣本中的靶序列實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增，從而達(dá)到對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)防污染。UNG可識(shí)別并裂解摻入U(xiǎn)的DNA鏈，但對(duì)含T的DNA卻不能起作用。擴(kuò)增體系中用dUTP代替dTTP后，造成擴(kuò)增產(chǎn)物均為含U的DNA鏈，而自然界的DNA均為含T的。因此體系中UNG在擴(kuò)增之前選擇性地裂解含U的擴(kuò)增產(chǎn)物，使其無(wú)法隨后被體系擴(kuò)增，而自然存在的靶DNA仍然正常進(jìn)行擴(kuò)增。
試劑盒規(guī)格:24tests/盒
試劑盒組成
*)校準(zhǔn)品具體拷貝數(shù)請(qǐng)參照校準(zhǔn)品包裝盒內(nèi)給定值
試劑盒儲(chǔ)存條件及有效期
裂解液應(yīng)為紅色液體，置4℃保存；
RT-PCR酶應(yīng)為白色圓形顆粒，在室溫條件下置于干燥器內(nèi)保存；使用前請(qǐng)注意觀察是否發(fā)生潮解:顏色變?yōu)椴糠只蛉客该�，形狀變小或變�(yōu)椴灰?guī)則，或完全蒸發(fā)，一旦潮解應(yīng)棄用；
Taq酶和UNG均應(yīng)為無(wú)色透明液體，置–20℃保存；
其他試劑均應(yīng)目測(cè)為無(wú)色透明液體，置–20℃保存，不宜反復(fù)凍融。使用前應(yīng)在室溫下完全融化，并充分振蕩混勻后稍事離心；
所有試劑避光保存；
所有試劑有效期為一年（請(qǐng)于有效期內(nèi)使用）。
自備物品
自備試劑(分析純)
自備儀器
PCR前準(zhǔn)備區(qū):小型離心機(jī)
移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul）
一次性耗材（吸頭、離心管、手套、帽子等）
專用工作服、工作鞋、辦公用品
樣本處理區(qū):高速冷凍離心機(jī)
PCR擴(kuò)增儀
移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul）
一次性耗材（吸頭、離心管、手套、帽子等）
專用工作服、工作鞋、辦公用品
檢測(cè)區(qū):小型離心機(jī)
移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul）
熒光PCR檢測(cè)儀
一次性耗材（吸頭、離心管、手套、帽子等）
專用工作服、工作鞋、辦公用品
建議使用離心管和吸頭一覽表
樣本采集、存放及運(yùn)輸
本試劑盒僅適用于血漿樣本。采集的全血用EDTA抗凝，肝素（Heparin）對(duì)PCR抑制，不能使用。
1．樣本采集:用無(wú)菌注射針頭采2ml靜脈血于含有抗凝劑的無(wú)菌離心管中，室溫放置不應(yīng)超過(guò)4hr，室溫1600g離心20min，分離血漿轉(zhuǎn)入無(wú)菌Eppendorf管中備用。
2．存放:分離后的血漿標(biāo)本在2℃—8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)5天；放置于-70℃條件下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（最多凍融3次）。
3．運(yùn)輸:血漿標(biāo)本應(yīng)在2℃—8℃或冷凍條件下進(jìn)行運(yùn)輸。
適用儀器
1．PE Gene Amp 7700熒光PCR檢測(cè)儀
2．Bio-Rad iCycler熒光PCR檢測(cè)儀
3．Roche LightCycler熒光PCR檢測(cè)儀
4．其他單通道熒光PCR檢測(cè)儀可以不使用內(nèi)標(biāo)實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV-1 RNA的檢測(cè)。
使用方法（使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書）
1．樣本處理（樣本處理區(qū)）
所有試劑、樣本使用前置室溫解凍。
1.1．使用裂解液的樣本處理操作流程
1.1.1.配制裂解液的工作液
首先計(jì)算所需裂解液的份數(shù)n（n=樣本數(shù)+1管強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照+1管臨界陽(yáng)性對(duì)照+1管陰性對(duì)照），按（n+1）×150ul的量取出裂解液加入適當(dāng)體積反應(yīng)管中，在其中按（n+1）×2ul的量加入內(nèi)標(biāo)，顛倒混勻10-15次，即成裂解液的工作液。該工作液當(dāng)天用完，否則應(yīng)蓋嚴(yán)管蓋密封后丟棄。
1.1.2.取n個(gè)0.5ml的滅菌離心管，作好標(biāo)記。
1.1.3.在上述每一個(gè)管中加入150ul裂解液的工作液，然后加入待測(cè)樣本和陰性對(duì)照50ul，2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照品管中各先分別加入陽(yáng)性對(duì)照25ul，然后加入陰性對(duì)照25ul(切不可將二者混合后加入)，用吸頭反復(fù)吸打混勻（一份樣本換用一個(gè)吸頭）；再加入50ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒混勻15次（不宜過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層）。
1.1.4.離心（13000rpm，15min）。
1.1.5.取與步驟1.1.2.中相同數(shù)量的0.5ml滅菌離心管，各加入100ul異丙醇和2ul RNasin，作好標(biāo)記。吸取步驟1.1.4.各管中的上層液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中（注意不要吸出中間層，該層富含DNA和蛋白質(zhì)），顛倒混勻。
1.1.6.離心（13000rpm，15min，注意固定離心管方向）。輕輕吸出上清；加入300ul 75%乙醇，顛倒洗滌。
1.1.7.離心（13000rpm，10min，注意固定離心管方向）。輕輕吸出上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。
1.1.8.離心（2000rpm，5sec，注意固定離心管方向），將管底部少量液體用微量加樣器吸干（一份樣本換用一個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面），室溫干燥5min（不宜過(guò)于干燥，以免RNA不溶）。
1.1.9.于干燥后的沉淀中加入8ul DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，離心5sec，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁?此時(shí)的RNA最易受RNase降解，請(qǐng)?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄）。
1.2．使用Roche公司的樣本處理試劑（High Pure Viral RNA Kit）操作流程:
1.2.1.提取試劑準(zhǔn)備:將40ml無(wú)水乙醇加入到Wash buffer中；將20ml無(wú)水乙醇加入到Inhibitor removal buffer中制成Inhibitor removal buffer工作液；用400 ul Elution buffer溶解Poly(A) carrier RNA后，分別向2瓶Binding buffer中各加入200ul,配制成Binding buffer工作液（此溶液在15—25℃條件下可保存3個(gè)月）。
1.2.2.取n個(gè)1.5ml體積的滅菌離心管（n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照+1管臨界陽(yáng)性對(duì)照），作好標(biāo)記。
1.2.3.按照（n＋1）×400ul的量取出Binding buffer工作液加入適當(dāng)體積反應(yīng)管中，在其中按（n+1）×2ul的量加入內(nèi)標(biāo)，顛倒混勻10-15次，即成含內(nèi)標(biāo)工作液。該工作液當(dāng)天用完，否則應(yīng)蓋嚴(yán)管蓋密封后丟棄。
1.2.4.在上述各管中加入400ul Binding buffer，然后分別加入待檢樣本、對(duì)照品各200ul，振蕩混勻，室溫放置10min后轉(zhuǎn)入套有集液管的提取柱，于8,000g離心15sec。
1.2.5.將裝有濾出液的集液管丟棄，換上新管，向提取柱中各加入500 Inhibitor removal buffer工作液，于8,000g離心1min。
1.2.6.將裝有濾出液的集液管丟棄，換上新管，向提取柱中加入450
